Formación de biofilms por cepas Escherichia coli verocitotoxigénica (VTEC) y Escherichia coli enteropatogénica (EPEC) sobre distintas superficies, sometidas a distintas condiciones de estrés

Los biofilms son definidos como comunidades complejas de microorganismos que crecen embebidos en una matriz extracelular producida por las propias celulas y adherida a una superficie viva o inerte, que presentan un fenotipo alterado comparado al de sus contrapartes planctonicas respecto de la tasa de crecimiento y la transcripcion genetica, y que pueden estar compuestos por una unica especie microbiana (mono-especie) o por varias especies diferentes (multi-especie). Uno de los principales problemas para la industria y la salud publica esta representado por la supervivencia y la capacidad de formar biofilms de microorganismos patogenos o alterantes sobre las superficies, utensilios y equipos en contacto con los alimentos y sobre dispositivos de uso medico como cateteres, protesis, entre otros. Los biofilms les permiten a las bacterias colonizar gran cantidad y diversidad de ambientes y resistir a condiciones adversas del ambiente que constituyen factores de estres como por ejemplo, la manipulacion, higiene, conservacion y composicion de materiales y alimentos. En la industria alimentaria los biofilms pueden formarse en superficie tales como plastico, cristal, madera, acero inoxidable y sobre los alimentos. Una desinfeccion insuficiente o inadecuada de las superficies o de los instrumentos en contacto con los alimentos, provoca un incremento en la contaminacion del producto y el desarrollo de toxiinfecciones alimentarias. La formacion de biofilms desarrollada mediante estudios in vitro, se ve influenciada por muchos factores, como por ejemplo, el medio de cultivo (composicion de nutrientes, temperatura, pH), el inoculo (el microorganismo que se estudia, numero de celulas), la hidrodinamica (sistemas de flujo continuo vs. cultivo estatico) y la superficie (rugosidad, carga superficial). De la combinacion de estos factores dependeran en gran medida los resultados que se obtengan, e incluso podrian llegar a variar aun utilizando el mismo microorganismo. Dentro de los microorganismos que pueden formar biofilm se encuentra Escherichia coli verotoxigenica (VTEC) y enteropatogenica (EPEC). VTEC es un patogeno emergente relacionado con la Salud Publica que puede causar enfermedades graves en humanos como colitis hemorragica (CH) y sindrome uremico hemolitico (SUH). El principal reservorio es el bovino, pudiendose transmitir al humano por medio de alimentos derivados, el contacto con los animales o su ambiente. EPEC son cepas diarreagenicas de E. coli que producen en las celulas intestinales lesiones histopatologicas de "adherencia y borrado" (A/E) del enterocito y que no producen toxinas tipo Shiga. Al igual que otras E. coli diarreagenicas, se transmite por via fecal- oral a traves de manos, agua y alimentos contaminados y su principal reservorio es el humano, especialmente los ninos con diarrea y ninos o adultos portadores asintomaticos. VTEC y EPEC poseen factores putativos de virulencia codificados en plasmidos y factores de adherencia que le permiten la adherencia y la colonizacion tanto de tejidos vivos como de superficies inertes, con la posibilidad de formar biofilms y persistir en el ambiente donde se encuentran. Este trabajo de Tesis tuvo como objetivo principal determinar la capacidad de formar biofilms de cepas VTEC y EPEC atipica sobre dos superficies inertes que pueden estar presentes en la industria alimentaria y el ambiente domestico (poliestireno y acero inoxidable) y evaluar los efectos que producen distintas condiciones de estres sobre el desarrollo de los biofilms. Ademas, se estudio la presencia de genes que codifican para adhesinas involucradas en la formacion de biofilms y otros factores de virulencia. Los aislamientos estudiados presentaron una gran variedad de perfiles geneticos que las hacen potencialmente patogenas para el ser humano ya que varios de estos genes estan implicados en danos a nivel celular o molecular en el huesped. Se pudo establecer una asociacion entre la categoria del animal y los sistemas de produccion, con los serotipos y la presencia/ausencia de distintos genes putativos de virulencia del megaplasmido y adhesinas implicados en la colonizacion del bovino. Los genes que codifican para fimbrias y factores de adherencia implicados en la formacion de biofilm, como fimCD y agn43, fueron encontrados tanto en VTEC como en aEPEC, los cuales otorgarian a ambos grupos la posibilidad de formar biofilm en ambientes con diversidad de nutrientes. En las cepas VTEC provenientes de casos clinicos se detectaron la mayoria de los genes implicados en la adherencia y la formacion de biofilm, siendo lpf uno de los genes que mas variacion mostro segun el serotipo (O157:H7 o no-O157). En esta Tesis se pudo evaluar tambien, la expresion de la fimbria curli bajo distintas condiciones de cultivo y en distintas etapas de la formacion de biofilm. Se obtuvieron resultados evidentes en cuanto a la expresion de la fimbria curli vinculada a la temperatura y los tiempos de incubacion. Es asi que las cepas presentaron fenotipos curli positivos a temperatura cercanas a los 20 °C y con mas de 48 h de incubacion; sin embargo, la formacion de biofilm en esas condiciones era generalmente menor a la obtenida a 37 °C. Con respecto a la formacion de biofilm en distintas condiciones de cultivo y superficies, los resultados obtenidos permitieron demostrar que todas las cepas analizadas fueron formadoras de biofilm (moderadas o fuertes) en condiciones estandares de cultivo, a 37 °C sobre poliestireno. La variable de estres que mayor afecto el desarrollo de biofilms sobre dicha superficie fue la temperatura. Las condiciones del medio de cultivo afectaron en mayor medida la formacion de biofilm sobre la superficie de acero inoxidable provocando que las cepas sean debiles formadoras o no formen biofilm. Tanto VTEC como aEPEC fueron fuertes formadoras de biofilm sobre superficie de poliestireno, y no se encontraron diferencias significativas entre las distintas condiciones del medio (estandar, acidico y alcoholico). En la mayoria de los casos, aEPEC fue mayor formadora de biofilm que VTEC y, dentro de VTEC, las cepas eae- fueron mejores formadoras de biofilms que cepas eae+. Esto resalta la importancia de tener en cuenta otros patotipos de E. coli y serotipos VTEC eae- a la hora de diagramar buenas practicas de manufactura e higiene y tecnicas de diagnostico para la industria de los alimentos. La simulacion de condiciones que pueden ser encontradas en la industria alimentaria (medio, superficie, temperatura) en el trabajo de Laboratorio, resulta una herramienta util y valiosa para conocer el comportamiento de los microorganismos que puedan transmitirse por alimentos y ser perjudiciales para la salud en humanos.