A method for the detection of the resting sporangia of potato wart disease (Synchytrium endobioticum) in the soil of old outbreak sites

SummaryA method is described for the sampling of soils of old potato wart outbreak sites and the extraction of the resting sporangia of the causative fungus.Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. by a process of wet-sieving and chloroform flotation. A procedure for isolating individual spores for germination test or further study is also described. The method has been successfully used to recover spores from soils from outbreaks which occurred from 4–70 years previously and has made possible the study of long-term survival and decline of resting spore populations in field soil.ZusammenfassungSchottland hat fast 10 000 ha Ackerland, auf welchem Kartoffelbau durch Regierungsver-ordnung wegen des Vorkommens von Kartoffelkrebs (Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc.) eingeschränkt ist. In vielen Fällen sind die Beschränkungen seit über 60 Jahren in Kraft. Obwohl bekannt ist, dass der Erreger zwischen 30 und 40 Jahre lang lebensfähig bleibt, ergibt sich die Notwendigkeit einer Studie über die Langlebigkeit und den Rückgang von Populationen von Dauersporangien in alten Herden vor der Rücknahme legislativer Restriktionen für den in betracht kommenden Anbau von Kartoffeln. Die beschriebene Methode wurde für diesen Zweck für die Gewinnung von Dauersporen entwickelt.Das Feld mit dem Krebsherd wird in Einheiten von 0,41 ha oder weniger unterteilt, ein 25 cm-Bohrer wird, für die Entnahme von 50 Bodenproben, gleichmässig über jede Einheit verteilt, für eine Sammelprobe von 1 kg verwendet. Diese wird luftgetrocknet, zerrieben, gesiebt und gemischt, dann wird eine 100 g-Einzelprobe für die Sporenextrahierung genommen. Unter Verwendung des in Abb. 1 gezeigten Apparates werden Einzelproben über Nacht in 0,1% Triton X100-Lösung eingeweicht, um Bodenaggregate auseinanderzubrechen. Der daraus entstehende aufgerührte Schlamm wird stufenweise auf den oberen Teil eines Siebsatzes mit 20 cm Durchmesser gepumpt. Die 6 Siebe sind bei der Maschenweite entsprechend in abnehmender Grösse (300, 180, 100, 75, 35 und 23,5 μm) angeordnet. Die Nassiebung erfolgt mittels Schüttelapparat, bis das Wasser an der Basis des Siebsatzes klar ist. Die Bodenfraktionen werden gewaschen und das Material in Sporengrösse von den letzten beiden Sieben in 50 ml Zentrifugen-röhrchen aus Propylen überführt, die mit antistatischer Lösung behandelt worden waren. Das sporenhaltige Material wird durch dreimalige Behandlung mit Aceton dehydriert; anschliessend wird zentrifugiert und die Sporangien durch Chloroform-Flotation separiert. Danach wird zentrifugiert und mit Hilfe des in Abb. 2 dargestellten Apparates mit Trichlorfluoräthan aufgeschwemmt. Sporangien und organische Masse werden gesammelt und gleichmässig auf eine 8 μm Celluloseester-Porenfiltermembran im Vakuum verteilt. Mikroskopische Präparate werden angefertigt, indem die Zellulosemembran auf eine 75×63 mm grosse Glasplatte aufgebracht wird und mit Methylacetat/Zedernölgemisch zum Klären und Erweichen der Membran und der teilweise eingebetteten Sporangien plus organischer Masse behandelt wird. Nach Abtrocknen wird die Membran mit 3–4 Tropfen Zedernöl behandelt und mit einem quadratischen 50 mm-Deckglas abgedeckt. Die Präparate werden mit Hilfe eines Mikroskopes mit mechanischer Führung (Kreuztisch) methodisch bei 100× Vergrösserung durchkontrolliert. Die entgültige Diagnose erfolgt dann bei 400-facher Vergrösserung. Sporangien für kritischere Untersuchungen oder Keimtests können vom Präparat durch Ausschneiden kleiner Quadrate der Zellulose mit der Spore in der Mitte gewonnen werden. Dieses Quadrat wird auf eine Polyamidmembran plaziert und die Zellulose mit Methylacetat aufgelöst, wobei die separierte Spore für Präparierung oder Test auf Lebensfähigkeit übrig bleibt.Der Apparat wird mit Ultraschall gereinigt, Kreuz-Kontaminationen werden durch Tauchen der Siebe in Hypochloridlösung vermieden.Die Methode konnte erfolgreich zur Untersuchung der Lebensfähigkeit und dem Rückgang von Populationen von Sporangien verwendet werden, wobei die untersuchten Bodenproben von Kartoffelkrebsherden 4 bis 71 Jahre alt waren.RésuméL'Ecosse a près de 10 000 ha de terre arable où la culture de la pomme de terre est limitée par décision gouvernementale en raison de la présence de galle verruqueuse due àSynchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. En de nombreux endroits, les restrictions sont en vigueur depuis plus de 60 ans alors que le pathogène semble se maintenir pendant 30 à 40 ans; il est donc nécesaire d'étudier la longétivité et la baisse des populations de sporanges dans les zones anciennement contaminées avant de considérer l'abrogation des restrictions législatives concernant cette culture. C'est pourquoi, la méthode décrite a été mise au point pour obtenir des sporanges.Le champ contaminé est divisé en unités de 0,41 ha au moins et 50 prélèvements de terre sont effectués à intervalles réguliers à l'aide d'une tarrière de 25 cm sur chaque unité, afin d'obtenir des échantillons d'1 kg. Ceux-ci sont séchés à l'air, broyés, tamisés et mélangés et des sous-échantillons de 100 g sont utilisés pour l'extraction de spores. A l'aide de l'appareil présenté dans la fig. 1, les sous-échantillons sont immergés toute une nuit dans une solution de 0,1% Triton X100 afin de séparer les agrégats et le dépôt résultant est maintenu en agitation et pompé vers le haut d'une colonne de tamisage de 20 cm de diamètre. Les mailles des 6 tamis vont en décroissant (300, 180, 100, 75, 35 et 23,5 μm). Le tamisage humide par secouage en à-coups est prolongé jusqu'à ce que l'eau à la base de la colonne soit claire. Les fractions de sol sont lavées et les particules correspondant à la dimension des spores et, provenent des deux derniers tamis sont transférés dans des tubes de propylène de 50 ml à centrifugation, préalablement traités avec une solution anti-statique. Ces particules sont déshydratées par 3 traitements à l'acétone, suivis d'une centrifugation et les sporanges sont obtenus après flotaison dans le chloroforme, centrifugation et séparation dans le trichlorotrifluoro-éthane, à l'aide de l'appareil illustré dans la fig. 2. Les sporanges et la matière organique sont recueillies et déposées uniformément sur une membrane sous-vide d'éther de cellulose avec des millipores de 8 μm. Les préparations microscopiques sont obtenues en appliquant la membrane de cellulose sur und plaque de verre de 75×63 mm montée dans un mélange méthyl-acétate/huile de bois de cèdre qui clarifie et assouplit la membrane et fixe partiellement les sporanges et la matière organique. La membrane séchée est traitée avec 3–4 gouttes d'huile de bois de cèdre et recouverte d'une lamelle de 50 mm de côté pour compléter les préparations. Celles-ci sont observées méthodiquement à un grossissement de 100 avec un microscope équipé d'une platine à charriot et le diagnostic final des sporanges est fait au grossissement 400. Les sporanges destinés à un examen plus fin ou à des tests de germination sont retriés de la préparation en découpant un petit carré de cellulose avec la spore en son centre. Cette surface est placée sur une membrane de polyamide et la cellulose est dissoute avec le méthyl-acétate, laissant la spore disponible pour un nouveau montage ou un test de viabilité.L'appareil est nettoyé par ultra-sons et les problèmes de contamination croisée sont évités en trempant les tamis dans une solution d'hypochlorite.Cette méthode a été utilisée avec succès pour étudier la longévite et la baisse des populations de sporanges extraites de sols contaminés par la galle verruqueuse depuis 4 à 71 ans.