Modification of the agar overlay assay: assessment of the influence of acrylics used in orthodontics on proliferation and differentiation of primary and transformed fibroblasts.

ZusammenfassungIn der Kieferorthopädie werden zur Herstellung herausnehmbarer Geräte hauptsächlich Kunststoffe auf der Basis von Methylmethacrylaten verwendet. Durch die Restmonomerabgabe besteht dabei die Gefahr einer toxinbedingten Schädigung von Zellen des Umgebungsgewebes. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch Erweiterung des klassischen Agar-Overlay-Tests histochemische Verfahren zum Nachweis von Zellschädigungen zu prüfen sowie durch den Vergleich konventionell eingesetzter transformierter Mausfibroblasten (L-929) mit primären humanen Gingivafibroblasten den Toxizitätsbegriff näher zu charakterisieren. Untersuchungskriterien waren die Zellproliferation, welche durch die Inkorporation des Basenanalogons Bromdesoxyuridin analysiert wurde, und die Zelldifferenzierung durch den Nachweis des fibroblastenspezifischen Intermediärfilaments Vimentin. So konnte nach Einwirken der getesteten Monomere unabhängig vom Zelltyp fluoreszenzoptisch eine hemmhofübergreifende Verminderung der Proliferation beobachtet werden. Demgegenüber waren noch einzelne mitotisch aktive Zellen im Zentrum des Hemmhofes sichtbar, die mit Neutralrot nicht immer zweifelsfrei anfärbbar waren. Der Nachweis des differenzierungsspezifischen Intermediärfilaments Vimentin war größenordnungsmäßig mit dem Entfärbungsgrad des klassischen Agar-Overlay-Tests nach Neutralrot-Gabe vergleichbar. Die Untersuchungen ergaben ferner, daß unter dem Einfluß der Monomere die Hemmhöfe bei primären Gingivafibroblasten deutlich kleiner waren (etwa ein Drittel) als bei der konventionell eingesetzten Mausfibroblasten-Zellinie. Die Befunde zeigen, daß der modifizierte Test mit der klassischen Vorgehensweise vergleichbar ist. Durch histochemische Untersuchungen charakteristischer Zelleigenschaften kann darüber hinaus die Bewertung der Neutralrot-Vitalfärbung bezüglich einer toxischen Materialeinwirkung ergänzt werden.SummaryIn orthodontics, removable acrylic appliances are preferably produced from methylmetacrylates. However, in the adjacent oral mucosal tissue, cell damage may be caused by the evaporation of residual monomer. The aim of this study was to modify the classic agar overlay assay in order to apply histochemical methods by comparing conventionally used transformed mouse fibroblasts (L-929) with primary human gingival fibroblasts to further elucidate the term toxicity. While proliferation was assessed via the incorporation of the base analogon bromdesoxyuridine, differentiation was investigated by detection of the fibroblast-specific intermediate filament vimentin. After the monomers had taken effect, reduced proliferation extending over the inhibition area was observed by indirect immunofluorescence, independent of cell type. In contrast to this observation, a few cells within the inhibition area which could not be clearly detected by neutral red staining still exhibited mitotic activity. Detection of the differentiation-specific intermediate filament vimentin was comparable with the degree of neutral red fading visible in the classic agar overlay assay. The study showed that the inhibition areas with primary gingival fibroblasts were smaller (approximately 1/3) after monomer action compared with conventionally applied transformed fibroblasts. The results indicate that the modified assay is comparable with the classic method. Evaluation of neutral red staining with respect to toxic material influence can moreover be supplemented by histochemical studies of typical cell properties.