Purification and characterisation of alkaline phosphotase enzyme from the periplasmic space of Escherichia coli C90 using different methods.

Alkaline phosphotase enzyme was purified from bacteria Escherichia coli C90 grown in phosphate-poor medium as stationary phase; using an ion exchange column packed with DEAE-cellulose as matrix and size exclusion chromatography using Sepharcryl S-300HR, equilibrated with Buffer A. The enzyme was extracted from the periplasmic space, external to the cell membrane. Previous studies with E. coli have shown increase in alkaline phosphatase activity upon phosphate deprivation with much of the enzyme released into the medium during osmotic shock, indicating that the enzyme is located either in the periplasmic space or is loosely bound to the cell wall. Initially, a DEAE column was used leading to 28% yield and 77 times fold purification, followed by Sephacryl gel filtration column giving 25% yield and 72 times fold purification; indicating loss of enzyme in the subsequent purification step. SDS PAGE analysis was carried out as a control and to compare the results with the spectroscopy. There was no clear decrease in the yield seen in the bands and the loss of enzyme was not observed with the gel analysis. It may, therefore, be assumed that the decrease in yield was due to some pipetting errors in the spectroscopy measurements. The native gel results show clear distinct bands for the 3 alkaline phosphotase isoenzymes, confirming that, the purification procedure for the enzyme was a success. Key Words: DEAE cellulose, SDS PAGE analysis, Sephacryl S-300HR L’enzyme phosphatase alkaline etait purifie de la bacterie Escherichia coli C90 cultive dans un medium pauvre en phosphate comme phase stationnaire utilisant une colonne d’echange d’ion enveloppee avec une cellulose DEAE comme matrice et exclusion de taille chromographique utilisant le Sepharcryl S-300HR equilibre avec le tampon A. L’enzyme etait extrait de l’espace periplasmique externe a la membrane cellulaire. Des etudes anterieures avec E. coli ont montre une augmentation en activite de la phosphatase alkaline sur la deficience en phosphate avec plus d’enzymes ejectes dans le media Durant le choc osmotique, montrant que l’enzyme est situe dans l’espace periplasmique ou simplement lie a la membrane cellulaire. Initialement, une colonne de DEAE etait utilisee avec pour rendement 28% et purifiee 77 fois, suivie d’une colonne de gel de filtration Sephacryl produisant 25% et 72 fois de purification; indicant une perte d’enzyme au cours de l’etape suivante de purification. L’analyse SDE PAGE etait conduite comme control et pour comparer les resultats avec la spectroscopie. Il n’y avait pas une diminution claire du rendement dans les bandes et la perte d’enzyme n’etait pas observee par l’analyse du gel. Il pourrait etre presume que la diminution du rendement etait due aux erreurs de pipettage lors des mesures spectroscopiques. Les resultats du gel natif montrent clairement des bandes distinctes pour 3 isoenzymes alkalines phosphatases confirmant que, la procedure de purification pour l’enzyme etait un success. Mots Cles: cellulose DEAE, analysise SDS PAGE, Sephacryl S-300HR