Identifikation geeigneter Nachweismöglichkeiten von hormonaktiven und reproduktionstoxischen Wirkungen in aquatischen Ökosystemen

ZusammenfassungHintergrund und Ziel Aus den Ergebnissen umfangreicher Forschungsprogramme, wie z. B. dem Schweizer Forschungsprojekt NFP50 „Hormonaktive Stoffe“ und deren Konsensplattformen zeigt sich ein zunehmender Handlungsbedarf hormonaktive Wirkungen in aquatischen Systemen nachweisen, bewerten und reduzieren zu können. Die EU-Strategie für endokrine Disruptoren beinhaltet als mittelfristige Maßnahmen die Beteiligung der „Organisation for Economic Co-operation and Development“ (OECD) durch die „Endocrine Disruptor Testing and Assessment Task Force“ (EDTA) und weitere Forschungsaktivitäten. Die Testverfahrensentwicklungen der OECD können erhebliche Beiträge zum Verständnis des Ausmaßes der endokrinen Disruption leisten, sofern diese auch auf Umweltproben angewendet und für Risikominderungsstrategien (z. B. Abwasserbehandlungen) eingesetzt werden. Ziel dieses Reviews ist es, eine Zusammenfassung und Bewertung von verfügbaren und in der Validierung befindlichen biologischen Testsystemen zu erstellen, mit denen Effekte hormonaktiver und reproduktionstoxischer Substanzen in Gewässern nachgewiesen werden können. Auf dieser Grundlage erfolgt eine Empfehlung einer ökotoxikologischen Testpalette, die es erlaubt, die unterschiedlichen Mechanismen der hormonaktiven Wirkungen und reproduktionsrelevanten Wirkungen zuverlässig in Umweltproben zu erfassen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf den Testverfahren für geschlechtshormonaktive Substanzen. Material und Methoden Ausgehend von einer Literaturrecherche und aktuellen internationalen Validierungsaktivitäten für Nachweismöglichkeiten hormonaktiver und reproduktionstoxischer Substanzen und Wirkungen wurden 15 biologische Testverfahren (5 In-vivo- und 10 In-vitro-Testverfahren) ausgewählt. Es wurden 8 Verfahren der OECD-EDTA erfasst und 3 von 5 In-vitro-Verfahren aus dem „Global Water Research Coalition“ (GWRC) Report: „Tools to detect estrogenic activity in environmental waters“ (Leusch 2008) ausgewählt. Für diese Testverfahren erfolgte eine Abfrage umfassender Kriterienprofile bei versierten Anwendern und Entwicklern, die vergleichend dargestellt und ausgewertet wurden. Ergebnisse Wichtige Kriterien bei der Auswahl der Testverfahren waren Normung/Validierung oder Verbreitung und Standardisierbarkeit der Tests sowie eine nachgewiesene Sensitivität in der Bewertung von Umweltproben. Bei den In-vitro-Tests erfüllen dies unserer Meinung nach bestimmte YES/YAS-Systeme (Yeast Estrogen/Androgen Screen Assay) und die ER/AR-Calux-Verfahren (Estrogen/Androgen Receptor). Sollte deren Anwendung durch starke zytotoxische Effekte in Umweltproben behindert werden, kann z. B. ein molekularer Rezeptorbindungsassay, wie der ELRA, Rezeptorbindungspotenziale nachweisen. Weitere molekulare Rezeptorbindungsassays sind derzeitig in der Validierung der OECD. Ebenfalls von der OECD für Einzelsubstanzen validiert, kann der H295R Steroidgenesis Assay Modulationen der Steroidgenese, und eventuell sogar aromatasemodulierende Effekte nachweisen. Seine Anwendbarkeit auf Umweltproben wird derzeitig getestet. Für die In-vivo-Stufe der modularen Testplattform wurden verschiedene Fischtests (z. B. der Fish Screening Assay und der Fischeitest) bewertet. Um Einflüsse auf das thyroidale Hormonsystem nachzuweisen ist der Amphibian Metamorphosis Assay (in der Abfrage unter XEMA, Xenopus Metamorphosis Assay) am weitesten validiert und wird bald als offizielle OECD-Richtlinie erscheinen. Da es sich auch hier um einen Vertebratentest handelt und internationale Bestrebungen bestehen Vertebratentests zu vermeiden, erfolgte nur eine optionale Empfehlung. Reproduktionstoxische Wirkungen können z. B. sehr sensitiv im Schneckenreproduktionstest mit Potamopyrgus antipodarum nachgewiesen werden. Dieser reagiert auch auf viele Substanzen, die in Vertebraten eine endokrine Disruption verursachen. Eine Validierung erfolgt derzeitig durch die OECD. Eine Eignung der in der modularen Testpalette vorgeschlagenen Verfahren für Umweltprobenbewertungen wurde angegeben und kann durch mehrere Literaturquellen belegt werden. Diskussion Es wurde eine anwendungsorientierte modulare Testpalette mit verschiedenen Testverfahren vorgeschlagen, die möglichst effektiv und vielseitig die Mechanismen der endokrinen Disruption und die Reproduktionstoxizität nachzuweisen vermögen und sich dabei in ihren Stärken und unterschiedlichen Arbeitsbereichen ergänzen. Es können fortpflanzungsrelevante Wirkungen an Invertebraten, Amphibien und Fischen und die wirkmechanistischen Ansätze der östrogenen und androgenen Rezeptorbindung, der Steroidgenese, eventuell sogar der Aromatasemodulation erfasst werden. Neuere Forschungsergebnisse, wie z. B. der Forschungsbericht zur Gewässerrelevanz endokriner Stoffe und Arzneimittel (Moltmann et al. 2007), konnten anhand aquatisch relevanter Schadstoffe mit In-vivo-Tests nachweisen, dass endokrine Endpunkte (bei 31 von 71 untersuchten Stoffen) empfindlicher sein können als allgemeine ökotoxikologische Endpunkte (z. B. Mortalität, Wachstum usw.). Daher wird empfohlen endokrine Effekte nicht isoliert zu betrachten, sondern parallel mit allgemeintoxischen und fortpflanzungsrelevanten Wirkungen in ökotoxikologischen Biotestpaletten integrativ zu erfassen. Schlussfolgerungen Durch die Kombination einer Literaturrecherche und der gezielten Abfrage von Informationen zu den Testverfahren konnte eine umfassende, aber auch detaillierte Übersicht zum derzeitigen Stand der Wissenschaft und Technik gegeben werden. Dabei wurden ökotoxikologische und regulative Aspekte der Testverfahren gleichermaßen berücksichtigt und deren Praktikabilität für ein Umweltmonitoring in aquatischen Systemen bewertet. Bei der Vielfältigkeit der endokrinen Wirkmechanismen bedarf es einer modularen Kombination von In-vivo- und In-vitro-Verfahren in einer Testpalette, um auch die fließenden Übergänge von hormonaktiven Wirkungen bis hin zu einer manifestierten endokrinen Disruption erfassen und differenzieren zu können. Empfehlungen und Perspektiven Die vorgestellte Testpalette erlaubt einen umfassenden Schutz vor hormonaktiven und reproduktionsrelevanten Effekten, wobei eine Anpassung an die Interessen und Zielsetzungen der Anwender erfolgen kann. Es werden sowohl die regulativen und ökotoxikologischen Anforderungen an Testsysteme als auch die aktuellen Entwicklungen in der EU und der OECD mit berücksichtigt. Eine weiterführende Normung dieser Verfahren für den regulativen Einsatz in der Umweltüberwachung und für Risikominderungsstrategien ist zu empfehlen. Das modulare System erlaubt es, einen anwendungsorientierten Austausch der Testmodule nach dem sich kontinuierlich entwickelnden Stand der Technik ohne Neuentwicklungen auszuschließen.AbstractBackground and objectives There is an urgent need to detect, assess, and reduce effects of hormonally active compounds and endocrine disrupters in aquatic systems, as reflected in national research programs like the Swiss NRP 50 “Endocrine Disruptors” and its consensus platforms. As a medium-term measure, the EU strategy on endocrine disruptors (SEC(2007)1635) uses the Endocrine Disruptor Testing and Assessment (EDTA) Task Force of the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) along with other research activities. In particular the test methods of the OECD that are currently in validation or already validated may contribute to a better understanding of the extent of endocrine disruption, in particular if they are applied on environmental samples and in the context of risk-assessment strategies, for instance in waste water treatment. This article aims to give an overview and an evaluation on available and validated biological test systems for the detection of endocrine disruptive and reproductive effects in aquatic systems. Based on this a recommendation for a modular ecotoxicological test platform is given. The study focuses on test methods for sex hormone active substances. Material and methods On the basis of an extensive literature search and ongoing international validation efforts by the OECD for methods to detect endocrine disruptive effects, 15 biological test methods (5 in vivo and 10 in vitro) were selected. Comprising, for example, of eight OECD methods and three out of five in-vitro methods mentioned in the Global Water Research Coalition (GWRC) report “Tools to detect estrogenic activity in environmental waters” (Leusch 2008). Experienced users and developers were then asked to rate the test according to given relevant criteria. The resulting criteria profiles were compiled, compared, and evaluated. Results The methods were selected on the basis of validation status, distribution, their suitability for standardisation, and their proven sensitivity for environmental samples. We assumed that specific YES/YAS-procedures and the ER/AR Calux systems achieve the mentioned criteria. In the case that strong cytotoxicity of environmental samples affects the applicability of cellular reporter gene assays, alternatively a molecular receptor binding assay (e. g. ELRA) could be used. Additional molecular receptor binding assays are currently in validation by the OECD. Modulating effects on steroidgenesis and probably even on aromatase activity can be detected by the OECD validated H295R Steroidgenesis Assay. Its applicability for environmental samples is currently tested. As in-vivo methods different fish assays (e. g. Fish Screening Assay and the Zebrafish Embryo Test) were evaluated. For the detection of effects on the thyroid-associated hormone system the Amphibian Metamorphosis Assay (XEMA, for Xenopus Metamorphosis Assay) will soon be available as an OECD-Guideline. Because of trends in the international community to avoid tests with vertebrates in the future, only an optional recommendation was given for such tests. Reproduction toxicity, on the other hand, can be sensitively tested by the tests using the gastropod Potamopyrgus antipodarum, which, as invertebrate tests, do not re